人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

一、產(chǎn)品基本信息

二、產(chǎn)品簡介

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell^?）自主研發(fā)的一款無外源動(dòng)物成分的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。可應(yīng)用于人臍帶組織來源的干細(xì)胞的原代分離、擴(kuò)增與傳代培養(yǎng)，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠(yuǎn)低于中國藥典標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)過程遵循 ISO9001 體系,并符合 GMP 指導(dǎo)原則。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素、無機(jī)鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、     微量元素，細(xì)胞因子等。

三、產(chǎn)品特性

l 無外源動(dòng)物蛋白成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險(xiǎn)。

l 全程無血清生產(chǎn)，極大降低批次間差異。

l 可用于原代分離，且培養(yǎng)過程無需包被培養(yǎng)板。

l 擴(kuò)增效率高，24h 左右增殖翻倍，節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間。

l 內(nèi)毒素<0.06EU/ml，遠(yuǎn)低于中國藥典水平

四、產(chǎn)品內(nèi)容

五、相關(guān)產(chǎn)品

無血清細(xì)胞凍存液（治療級）（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001006） 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001003）

細(xì)胞消化液（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001024）

六、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基配制

1. 37℃快速解凍人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清添加劑，快速溶解時(shí)不易破壞添加劑中營養(yǎng)物質(zhì)，時(shí)間大致     為 10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲(chǔ)存于

-20℃至-80℃，避免反復(fù)凍融 。

2. 將添加劑以 10%比例加入到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，即為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001043PRF）。混合后培養(yǎng)基可在 2-8℃ 穩(wěn)定儲(chǔ)存 2-3 周，不建議使用已配制超過 3 周的培養(yǎng)基。

3. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基可直接應(yīng)用于人類臍帶組織來源的干細(xì)胞的原代分離、擴(kuò)增與傳代     培養(yǎng)。

4. 預(yù)先高溫高壓滅菌處理剪刀，鑷子等實(shí)驗(yàn)器械。

5. 預(yù)先紫外滅菌超凈臺(tái)/安全柜等實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)

1. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代分離（貼壁法）

臍帶簡介：臍帶包括臍帶血、華通氏膠、兩根動(dòng)脈、一根靜脈，所有這些結(jié)構(gòu)被臍帶上皮（內(nèi)襯膜）     包裹。臍帶是間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來源，其中華通氏膠只含有間充質(zhì)干細(xì)胞一種干細(xì)胞，是最常用來分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。而內(nèi)襯膜則含有至少兩種干細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞，這兩種干細(xì)胞也是細(xì)胞治療的主要來源。

以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞詳細(xì)步驟：

1.1. 無菌收集長度約 10cm 的臍帶，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液（AC-1001016）的 50mL 離心管中。在 4℃條件下快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在 4h 內(nèi)處理完成全部過程。

1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑 10cm 培養(yǎng)皿中。用預(yù)冷的PBS 多次清洗臍帶，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過程確保全程臍帶浸泡在預(yù)冷PBS 中保持濕潤。

1.3. 使用剪刀徑向剖開臍帶，將血管以及周圍的華通氏膠暴露出來。

1.4. 用解剖刀將華通氏膠與血管分離，用鑷子夾住血管，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人    類臍帶結(jié)構(gòu)參見圖 1） 。

1.5.用剪刀將華通氏膠剪成 0.5-1cm 見方的薄片組織塊，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內(nèi)襯膜）組織 棄除。

注意：組織塊盡量接近片狀，增大與培養(yǎng)皿接觸面積，提高細(xì)胞爬出率

1.6. 每個(gè)直徑 10cm 的培養(yǎng)皿中放置 10-15 個(gè)組織塊，加入 6mL 完全培養(yǎng)基。置于 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 不同原代分離體系初始組織塊數(shù)量以及細(xì)胞爬出率見表 1。

注意：①為促進(jìn)組織塊貼壁，培養(yǎng)基不能加太多，否則組織塊容易漂起

②為促進(jìn)組織塊貼壁，72 小時(shí)內(nèi)不能搖晃培養(yǎng)皿，72 小時(shí)第一次換液也是同理。

表 1 臍帶組織塊粘壁數(shù)據(jù)（平均數(shù)據(jù)）

1.3. 每 72 小時(shí)換液。一般 5-7 天可以看見貼壁組織塊附近有細(xì)胞爬出，12-15 天細(xì)胞匯合度達(dá)到 70% 以上，即可準(zhǔn)備傳代。

1.4. 細(xì)胞傳代時(shí)，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養(yǎng)基，加入 5mlPBS 清洗一次。每個(gè)直徑 10ml，的培養(yǎng)皿中加入 5ml 的細(xì)胞消化液（AC-1001024 ），搖勻覆蓋皿底，37℃恒溫箱 2-3min 或室溫3-5min 孵育。

1.5. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿底，輕輕敲打皿底，細(xì)胞呈細(xì)沙狀脫落，加入同體積完    全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細(xì)胞完全脫落下來，將細(xì)胞懸液收集到 15mL 離心管中，300×g 離心 5min。

1.6. 用完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，此時(shí)的細(xì)胞稱為P0 代。相關(guān)代次預(yù)期收獲細(xì)胞量請參考表 2。

1.7. 根據(jù)本公司統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，10cm 長的臍帶，約可以收獲 1.24×10⁷ 個(gè)P0 代細(xì)胞，一根臍帶長度大約 20cm，約可以收獲 2.5×10⁷ 個(gè)P0 代細(xì)胞。

1.8. 根據(jù)本公司檢測，按 1:8 傳代，細(xì)胞形態(tài)在P10 代內(nèi)不發(fā)生變化。P10 代以上細(xì)胞沒有實(shí)際應(yīng)用意義，暫不檢測。

1.9. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異，近胎盤端分離效率要高于近胎兒端 10-30%。

表 2 10cm 長的臍帶P0-P5 代預(yù)計(jì)收獲細(xì)胞數(shù)量（1:8 傳代）

2. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)

2.1. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)到 90%，即可準(zhǔn)備傳代;

2.2. 吸掉培養(yǎng)瓶/皿中的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗一次，加入適量的細(xì)胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/ 皿底，37℃恒溫箱 2-3min 或室溫 3-5min 孵育。

2.3. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離瓶/皿底，輕輕敲打瓶/皿底，細(xì)胞呈細(xì)沙狀脫落，加入等    倍體積的完全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細(xì)胞脫落下來，并輕輕吹打成單細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集    到適當(dāng)?shù)碾x心管中，室溫 300×g 離心 5min。

2.4. 棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，按照比例進(jìn)行傳代或計(jì)數(shù)后按照 1.1-1.45×104 個(gè)/cm2 密度進(jìn)行接種。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于 37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng)。相關(guān)數(shù)據(jù)請見表 3。

注意：細(xì)胞規(guī)模生產(chǎn)建議 1:5-1:8 傳代，一般 72 小時(shí)可以達(dá)到 90%以上匯合度。

表 3 不同體系建議細(xì)胞接種數(shù)量及加液量

3. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存

       3.1. 同步驟 2.1；

       3.2. 同步驟 2.2；

       3.3. 同步驟 2.3；

3.4. 棄上清，用 4℃保存的無血清細(xì)胞凍存液（治療級）（AC-1001006）重懸細(xì)胞，取部分細(xì)胞計(jì)數(shù)。

注意：無血清細(xì)胞凍存液即拿即用，用完之后盡快放回 4℃冰箱，以防室溫放置太久，影響質(zhì)量。

3.5. 計(jì)數(shù)后用無血清細(xì)胞凍存液（治療級）（AC-1001006）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至建議凍存密度   1-5×10⁶ 個(gè)/mL，每支凍存管（需提前做好標(biāo)記）分裝 1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存。

3.6. -80℃放置過夜后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

4. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇

4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解。

4.2.在生物安全柜或超凈臺(tái)中，先在 15mL 離心管中加入 5 mL 37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，將解凍后的細(xì)胞懸液緩慢滴加到離心管中。

4.3.300×g 離心 3min，吸掉上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至建議接種濃度（參考表 3）。

4.5.將細(xì)胞懸液均勻滴加到培養(yǎng)瓶/皿中，水平十字振動(dòng)培養(yǎng)瓶/皿使細(xì)胞均勻。置于 37℃，5% CO2 條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)后觀察細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)。

4.6.細(xì)胞無異常即可同時(shí)更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.7.初次換液后每 48-72 小時(shí)更換培養(yǎng)液直至傳代。

八、質(zhì)量控制