血管內皮生長因子 (VEGF) 是一種已知參與許多生理和病理事件的自身糖蛋白。該分子是用于癌癥治療的抗血管生成的主要靶標。第一個針對促血管生成因子的治療產品是一種人源化的抗VEGF mAb，稱為貝伐珠單抗。
1.概述
研究歷史記錄抗貝伐珠單抗的獨特型mAb，10.D7，它能促使血管內皮生長因子和抗體結合，并在腫瘤小鼠模型中顯示出相當?shù)闹委煗摿Α?022年12月8日，圣保羅聯(lián)邦大學的Tábata Almeida Silva團隊在Nature上發(fā)表一篇名為《Potential of an anti-bevacizumab idiotype scFv DNA-based immunization to elicit VEGF-binding antibody response》的文章，旨在評估10.D7 mAb的scFv在用作免疫原時是否能保持相應全長mAb的抗獨特型特性并激活VEGF結合的抗體反應。
2.2.材料和方法

細胞培養(yǎng)
HEK 293 T細胞（ATCC，Manassas，VA，USA）在DMEM（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培養(yǎng)，而B16-F10細胞（ATCC）在RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific）中培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)基都補充了10%的胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific）。
10.D7雜交瘤細胞維持在含有10% FBS和50μM 2-巰基乙醇的RPMI-1640中。
所有細胞在37°C和5%二氧化碳的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，并定期檢查支原體污染。

10.D7 scFv基因的構建
用TRIzol (Thermo Fisher Scientific)從106個10.D7 雜交瘤細胞中分離總 RNA。如前所述，使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）（表 1）分別用寡核苷酸A和C合成VH 和 VL 的 cDNA。

然后分別使用 A + B 和 C + D 寡核苷酸對（每個 1 μM）通過 PCR 擴增編碼 10.D7 mAb 的 VH 和 VL 結構域的 DNA 片段（表1).

表 1 用于從 10.D7 mAb 分離 VH 和 VL 的引物序列
抗體重鏈擴增條件為：94℃ 3 min；40個循環(huán)94℃1分鐘，62℃30秒，72℃1分鐘；最后在 72 °C 下孵育 5 分鐘。輕鏈擴增條件為：94℃ 3 min；40個循環(huán)，94°C 1分鐘，60°C 30秒，72°C 1分鐘；在 72 °C 下保持 5 分鐘。

動物
6-8 周大的雄性 C57Bl/6 小鼠來自于“Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia”（CEDEME/UNIFESP，巴西），并保持光暗12:12小時進行循環(huán)和水自由采食。在用氯胺酮 (100 mg/kg; Syntec, Brazil) 和甲苯噻嗪 (10 mg/kg; Syntec) 進行麻醉誘導后進行實驗。小鼠因麻醉劑過量而被安樂死。所有程序均符合美國國家研究委員會關于實驗室動物護理和使用的指南。

酶免疫測定 (ELISA) 研究
分別進行細胞結合ELISA測定以評估 10.D7 scFv 基因轉染的細胞是否被貝伐珠單抗識別，間接 ELISA 以檢測血清樣品中的 VEGF 結合抗體。
在這兩種測定中，在室溫下與過氧化物酶-鏈霉親和素 (Sigma) 孵育 30 分鐘后，用鄰苯二胺底物 (Sigma)顯色孔。用 4 NH 2 SO 4 (Merck, Germany)終止反應，并在 490 nm 處讀取吸光度值。

3.結果與討論
輕鏈 (L) 和重鏈 (H) 的可變區(qū) (Fv) 的基因從 10.D7 雜交瘤細胞中分離，測序，并用于構建 VH-VL 方向的常規(guī) scFv。

圖a：顯示 340-bp 和 324-bp 條帶，分別指純化的 FvH 和 FvL 產品，這些序列的 BLAST 分析顯示分別與其他 FvH 和 FvL 小鼠免疫球蛋白鏈具有 ~94% 和 ~97% 的同源性。

圖b：用EcoRI/HindIII消化構建的質粒DNA釋放出約830-bp的插入片段，其可能對應于scFv基因。

設計的 scFv 可以保留親本全長 mAb 的貝伐珠單抗結合能力，表達的 10.D7 scFv 可能模擬 VEGF 并誘導包含對 VEGF 反應的抗體的免疫反應，并且有明顯的抗腫瘤活性。

4.結論
綜上，我們的結果揭示了一種有前景的 scFv，它可以保留先前描述的親本 mAb 的抗貝伐珠單抗 Id 特征?；讵毺匦途W(wǎng)絡，設計的結構有可能在 DNA（甚至 mRNA）疫苗中探索以激活 VEGF 結合反應

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ELISA即酶聯(lián)免疫吸附反應分析，是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的方法。其是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體上，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，可對抗原或者抗體進行定性或者定量測定。