上海卓康以質量為本，樹立“卓康質量”是公司的發(fā)展目標。我們一直加倍努力，竭盡全力做到不辜負您的支持與信賴。同時公司也離不開廣大客戶的幫助支持，真誠邀請國內外有實力的實驗室、生物技術公司合作，共同發(fā)展。 目前卓康提供的服務范圍包括：生物合成siRNA、shRNA的制備；轉錄編碼shRNA的DNAs、轉錄編碼shRNA的質粒載體訂購；siRNA靶位的設計和實驗選擇分析；siRNA相關試劑和RNA技術相關產品的代理銷售；重組病毒構建包裝；基因蛋白表達、載體構建、多克隆抗體和單克隆抗體制備；多種細胞學服務；常用的分子生物學試劑、實驗儀器、實驗耗材銷售等。 卓康在分子生物學和免疫學實驗技術，特別抗體制備技術方面同樣具有豐富經驗，提供快速、優(yōu)質、性價比高的實驗服務。 十、代做實驗實時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術服務（代做RT-PCR實驗） ●熒光定量PCR概述 　　聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進行精確定量的有力工具。隨著分子生物學技術研究的不斷進展，定量PCR技術取得了突飛猛進的發(fā)展，實時定量PCR (real-time quantitative PCR)技術便是一種具有革命性意義的定量PCR技術。所謂實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。 　　目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關鍵詞的文章就達1000多篇。實時PCR技術較之以前的以終點法進行定量的PCR技術具有無與倫比的優(yōu)勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行操作。 　　實時熒光定量PCR技術即是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產物檢測定量產生的偏差，提高實驗的重復性。該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果。 Sunbio為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，定量PCR儀器為Corbett Research 公司生產的離心式實時定量PCR儀Rotor-Gene 3000。 ●熒光定量化學原理介紹 ☆TaqMan熒光探針 PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。如圖所示。 ☆SYBR Green熒光染料 SYBR Green是一種DNA結合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應體系中。從經濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合，所以一旦反應體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應條件以消除非特異性影響。 ●熒光定量PCR中的一些術語 1. CT值：熒光信號有統(tǒng)計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)，或者說是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。 2. 閾值：閾值的默認設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。 3.CT值與起始模板的量成線性關系，數(shù)學原理如圖所示： ●主要實驗步驟如下： 1. 設計并合成Realtime PCR引物。 2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG（SYBR® Green）的PCR反應的優(yōu)化。 3. 客戶樣品RNA抽提 實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。 實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 4. RNA質量檢測 a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度 b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。 5. 使用逆轉錄酶（Promega）進行反應，將樣品RNA逆轉錄為cDNA。 6. 制備標準曲線樣品： 進行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增，其產物進行梯度稀釋用于做標準曲線。 7. 標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應液中（其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司），進行RealTime PCR擴增和檢測。 8. 檢測結果進行標準曲線分析：以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的基因相對含量。 9. 提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結果的相關圖表 ●實時定量PCR全套技術服務收費標準 ☆實驗步驟 1至9個標本10個標本以上 組織或細胞RNA抽提 RNA質量檢測 cDNA制備 300元(一個組織或細胞標本) 270元(一個組織或細胞標本) 目的基因實時定量PCR 看家基因實時定量PCR 標準曲線制備 數(shù)據(jù)分析 200元(一個標本一個指標) 標準曲線制備及看家基因內參免費 180元(一個標本一個指標) 標準曲線制備及看家基因內參免費 ☆全套技術服務 您只需提供組織或細胞標本，我們?yōu)槟瓿蒖NA抽提，cDNA制備，實時定量PCR，標準曲線制備及數(shù)據(jù)分析的所有步驟。 標本的運輸費用及引物合成費用客戶自理 如需制作PCR電泳效果圖，每張(1至9個標本一張)收取100元 上海卓康生物科技有限公司 聯(lián)系電話：021－55660344，021－55063976 傳真：021－55660344 網址：www.elisabio.com 網址：www.antibodybio.com 聯(lián)系人：黃力，業(yè)務qq: 909447355 公司對外郵箱：sales@elisabio.com，hyperheal@gmail.com