概述

黃曲霉毒素是由多種霉菌代謝的毒性產(chǎn)物，例如Asperillus flavus和Asperillus parasiticus霉菌。他們具有致癌性，存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽和其它食品或動(dòng)物飼料中。谷物可能被黃曲霉毒素的衍生物：B1、B2、G1和G2其中一種或幾種污染。AFB1是目前檢測(cè)到的最毒的黃曲霉毒素，其他類型的黃曲霉毒素如果污染的濃度很高也存在很大的危險(xiǎn)。黃曲霉毒素能夠引發(fā)人類很多病癥包括肝癌、黃曲霉中毒、萊耶綜合癥和慢性肝炎。動(dòng)物容易攝取到黃曲霉毒素的原因是動(dòng)物吃的飼料在生長(zhǎng)、收割和貯存過(guò)程中可能被能夠產(chǎn)生黃曲霉毒素的真菌污染。世界上大多數(shù)國(guó)家的政府已經(jīng)對(duì)人類和動(dòng)物性食品中制定了嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。

適用

REAGEN黃曲霉毒素B1分析測(cè)定試劑盒原理是競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，適用于檢測(cè)谷物、堅(jiān)果、棉花種子、加工過(guò)的谷類食物、和一些其它的動(dòng)物食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2。

原理

REAGEN黃曲霉毒素B1測(cè)定法是一種固相直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析測(cè)定方法。聚苯乙烯微孔板中包被抗黃曲霉毒素的高親和力抗體，這種抗體和黃曲霉毒素的四種亞型都能發(fā)生交叉反應(yīng)。利用70%甲醇提取樣品中的黃曲霉毒素，把提取的樣品和HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的黃曲霉毒素B1混勻并加入對(duì)應(yīng)的孔檢測(cè)。酶標(biāo)記毒素與標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品中黃曲霉毒素競(jìng)爭(zhēng)與包被在微孔底部的抗體結(jié)合。孵育一段時(shí)間后，倒出孔里的液體，清洗后加入顯色底物，在酶的作用下孔里將會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。顯色顏色的深淺與結(jié)合物的量成正比例的關(guān)系，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中AFM的量成反比例關(guān)系。所以，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的AFM濃度越高，顯色的藍(lán)色將會(huì)越淺。加入酸，終止反應(yīng)，底物顏色由藍(lán)色變?yōu)樽攸S色。微孔板放進(jìn)酶標(biāo)儀里，在OD450nm讀取吸光度值。樣品的吸光度值與試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)OD值相比較，相對(duì)應(yīng)得出結(jié)果。

試劑盒組成
1×小袋
抗體包被的微孔板
96孔板（12×8微孔板用鼠源AF單克隆抗體）

1×
預(yù)混板（綠色）
96孔板（12×8）沒(méi)有包被抗體

6×小瓶
AFM標(biāo)準(zhǔn)品
1.5mL/瓶，AFM的濃度分別為0.0、0.2、0.5、

1．0、2.0、4.0ng/mL 溶解在有機(jī)溶液中。

2×小瓶
HRP-AF偶聯(lián)物
2 x 12mL HRP-AFB1添加防腐劑

的緩沖溶液

1×小瓶
底物試劑
15mL TMB，

1×小瓶
終止液
15mL酸性液體


樣品提取步驟

1.制備提取液：70%甲醇，用蒸餾水或無(wú)離子水稀釋（每個(gè)樣品需要100ml樣品提取液）。

2.研磨樣品（使50%的樣品可以通過(guò)一個(gè)20目的濾網(wǎng)）。

3.稱量20g研磨過(guò)濾后的樣品加入100ml樣品提取液，樣品稀釋比為1:5(w/v)。

4.在混合器上至少震蕩2分鐘。

5.用濾紙過(guò)濾5-10ml 以上處理的液體，收集濾液待測(cè)。

樣品測(cè)定步驟

1、使用前將試劑拿到室溫。

2、取出混合板放于微孔支架上用于標(biāo)準(zhǔn)和樣品的測(cè)試，取相同數(shù)量的微孔（包被有抗體）置于另一個(gè)微孔支架上。

3、在每個(gè)混合板微孔中加入 200μl酶標(biāo)結(jié)合物。

4、在對(duì)應(yīng)的孔中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)或樣品，用槍頭混合3次，

注意：操作者要把每個(gè)孔標(biāo)記清楚

5、轉(zhuǎn)移100ul預(yù)混板微孔中的液體到對(duì)應(yīng)的包被有抗體的微孔中，室溫孵育15分，最好使用多道移液器。

6、將孔里的液體倒入合適的容器中，用蒸餾水或無(wú)離子水洗板，然后迅速棄掉洗液到合適的容器中，重復(fù)洗5次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。

7、在吸水紙上拍打，盡可能地將水拍干。

8、每孔加入100μl底物溶劑，室溫孵育5min。

9、每孔加入100μl終止液。

10、對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)和樣品的顏色，或在OD450 nm讀數(shù)。



結(jié)果分析

使用原有的OD值或?qū)嶒?yàn)獲得的OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線中黃曲霉毒素濃度為0時(shí)OD值的百分比值與標(biāo)準(zhǔn)中黃曲霉毒素含量建立劑量效應(yīng)曲線。通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)品曲線中添加新數(shù)值計(jì)算被測(cè)物質(zhì)中黃曲霉毒素的濃度。因?yàn)闃悠吩谔幚淼倪^(guò)程中稀釋了5倍，所以實(shí)際值是測(cè)定值的5倍。樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的稀釋范圍是1-20ppb，如果樣品的濃度大于最高標(biāo)準(zhǔn)，需要用70%的樣品提取液來(lái)稀釋后再測(cè)定，計(jì)算結(jié)果時(shí)要考慮到稀釋的倍數(shù)。